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桂花浸膏酶法制备工艺优化

时间:2019-08-12 09:34  来源:未知  阅读次数: 复制分享 我要评论

  (1. 江苏农林职业手艺学院,江苏 句容 212400;2. 南京林业大学,江苏 南京 210037;3. 国际竹藤核心,北京 100714)

  摘要:为改良木樨浸膏制备工艺,提高木樨浸膏得率及质量,试验在多种风味水解酶中优选,确定采用β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配对木樨进行酶处置,酶处置的木樨用石油醚提取制备木樨浸膏,产品采用GC-MS联用仪进行阐发。操纵响应面阐发法优化复合酶法处置木樨制备木樨浸膏的工艺前提,并成立靠得住的多元二次回归模子。成果表白,pH为4.7、酶解时间2.6 h、酶解温度46 ℃、液料比19.8∶1 (mL/g)、复合酶添加量54.4 IU/g、β-葡萄糖苷酶占总酶活的48.1%,该前提下木樨浸膏得率为3.32%,比间接提取所得浸膏得率提高了62.75%。同时GC-MS检测表白采用β-葡萄糖苷酶-果胶酶复配处置对木樨浸膏的质量有较大提拔,浸膏中次要化合物的数量有所添加,与对拍照比浸膏中二氢芳樟醇、γ-癸内酯、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、香叶醇、柠檬烯等次要香气物质的含量别离提高了27.27%,116.36%,100.00%,247.06%,72.84% ,14.29%,并检测出橙花叔醇和β-紫罗兰醇。木樨经β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配酶处置后,其浸膏得率及呈香质量均能无效提高。

  环节词:木樨;浸膏;复配酶;风味酶

  木樨是一种主要的经济抚玩动物,普遍分布于中国、日本、泰国等东南亚国度,特别在中国分布最广,使用最多,品种资本极其丰硕,在中国有2 500多年的栽培汗青[1-2]。木樨的芬芳和其生物学功能使得木樨备受关心。除了作为功能性食物添加剂外[3],木樨还有庞大的药用价值[4-6]。木樨浸膏的香味文雅,可普遍用于化妆品、香精香料出产中,已远销海外。保守的木樨浸膏制备工艺所得木樨产物产率及质量较低,具有操纵不充实等错误谬误[7]。目前,国表里对木樨产物的研究次要为两大类:① 采用超临界CO2手艺提取木樨浸膏、精油的工艺方式[8];② 木樨精油产物成分的阐发检测手艺[9-10]。此中,超临界流体萃取为获得高质量的木樨香料供给了手艺包管[11]。该手艺具有平安、环保和提取针对性强等长处,但因前期设备投资大,后期设备运转和维护成本高,目前还很难实现工业化出产[12-13]。

  跟着现代生物手艺的成长,外源生物酶在动物提取和加工手艺中的利用越来越普遍。目前,国际上香料出产中采用生物手艺成为总体成长趋向。糖苷类香气前体是香料动物潜在的香气源[14],操纵酶水解手艺以提高香料产物得率和产质量量是当前国表里学者的次要研究标的目的[15]。杨志萍等[16]曾操纵葡萄糖苷酶处置新颖木樨,提高了顺、反-氧化芳樟醇,L-芳樟醇,萜烯二醇,L-α-萜品醇等香气成分的含量。

  当前,木樨香料产物的市场价钱持续走高,改良木樨香料产物的提取加工手艺,提高产物得率和质量是木樨行业深加工过程中急需处理的问题。本试验通过筛选一些常用风味水解酶后,选择纤维素酶和果胶酶复配对木樨进行酶处置,基于单要素试验的最优前提,操纵响应面优化复配酶提取工艺前提,以提高木樨浸膏的得率及次要香气物质含量。

  木樨:金桂,产地为浙江,50 ℃干燥后破坏,过40目筛;

  柠檬酸氢二钠、、石油醚、柠檬酸:阐发纯,国药集团化学试剂无限公司;

  正己烷:色谱纯,国药集团化学试剂无限公司;

  β-葡萄糖苷酶(100 IU/g)、果胶酶(200 000 IU/g):南京奥多福尼生物科技无限公司;

  扭转蒸发器:RE-5220型,上海亚荣生化仪器厂;

  线型,上海细密仪器仪表公司;

  破坏机:FW177型,天津市泰斯特仪器无限公司;

  电子数显不锈钢恒温水浴锅:HHS112-B型,上海宜昌仪器厂;

  酸度计:HS-25型,上海雷磁仪器厂。

  1.2.1 酶处置 称取15 g破坏后的木樨,以50 IU/g干木樨,别离选用果胶酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖酶、鼠李糖苷酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶1以及β-葡萄糖苷酶3在其最适宜前提下,按液料比15∶1 (mL/g)酶解2 h。减压过滤后,将酶处置后的木樨在40 ℃下线 g破坏后的木樨颠末酶液处置所得木樨腔品。

  (2) 样品B:15 g破坏后的木樨不加酶处置所得空白对照样品。

  (3) 样品C:15 g破坏后的干木樨腔品。

  (4) 木樨浸膏制备:别离将A、B、C 3种样品,按液料比15∶1 (mL/g),用石油醚40 ℃回流提取1 h。将提取液过滤,滤液经扭转蒸发浓缩去除石油醚,经40 ℃真空干燥获得木樨浸膏。木樨浸膏经正己烷消融后,采用GC-MS对其成分进行检测。按式(1)计较浸膏得率。

  ——浸膏得率,%;

  ——干燥后浸膏质量,g;m

  ——原料质量,g。1.3 GC-MS检测检测前提参照文献[17]。

  (1) pH对木樨浸膏得率的影响:设定50 IU/g·原料插手

  -葡萄糖苷酶与果胶酶酶活之比为1∶1、温度45 ℃、液料比15∶1 (mL/g),别离节制pH为3.5,4.0,4.5,5.0,5.5处置木樨2 h,调查pH对木樨浸膏得率的影响。(2) 温度对木樨浸膏得率的影响:设定50 IU/g·原料插手β-葡萄糖苷酶-果胶酶复配酶处置木樨,复合酶中

  -葡萄糖苷酶与果胶酶酶活之比为1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5,别离节制温度为35,40,45,50,55 ℃处置木樨2 h,调查温度对木樨浸膏得率的影响。(3) 酶解时间对木樨浸膏得率的影响:设定50 IU/g·原料插手β-葡萄糖苷酶-果胶酶复配酶处置木樨,复合酶中

  -葡萄糖苷酶与果胶酶酶活之比为1∶1、液料比15∶1 (mL/g)、pH 4.5、温度45 ℃,别离节制酶解时间为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h,调查酶解时间对木樨浸膏得率的影响。(4) 液料比对木樨浸膏得率的影响:设定50 IU/g·原料插手β-葡萄糖苷酶-果胶酶复配酶处置木樨,复合酶中

  -葡萄糖苷酶与果胶酶酶活之比为1∶1、pH 4.5、温度45 ℃,别离节制液料比为5∶1, 10∶1,15∶1,20∶1,25∶1 (mL/g)处置木樨2.5 h,调查液料比对木樨浸膏得率的影响。(5) 加酶量对木樨浸膏得率的影响:设定复合酶中β-葡萄糖苷酶与果胶酶酶活之比为1∶1、pH 4.5、温度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g),别离节制插手

  -葡萄糖苷酶-果胶酶复配酶的量为20,30,40,50,60,70 IU/g·原料处置木樨2.5 h,调查加酶量对木樨浸膏得率的影响。(6)β-葡萄糖苷酶比例对木樨浸膏得率的影响:设定50 IU/g·原料插手

  -葡萄糖苷酶-果胶酶复配酶处置木樨,pH 4.5、温度45 ℃、液料比20∶1 (mL/g),别离节制β-葡萄糖苷酶比例为0%,30%,40%,50%,60%,70%,100%处置木樨2.5 h,调查β-葡萄糖苷酶比例对木樨浸膏得率的影响。1.5 响应面试验以木樨浸膏得率为权衡目标,采用响应面软件Design-Expert V8.0进行试验设想。

  显著性差别阐发采用统计阐发软件SPSS19。

  2.1 多种酶处置对木樨浸膏得率的影响

  -葡萄糖苷酶和果胶酶处置木樨所得木樨浸膏得率均高于间接提取,且

  -葡萄糖苷酶处置后木樨浸膏得率与间接提取比拟提高20.10%,果胶酶处置高于间接提取2.45%。β-葡萄糖苷酶与果胶酶均有助于提高木樨浸膏得率,且最适前提比力接近,本试验选择β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配对木樨进行酶处置。2.2β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配处置对木樨浸膏得率的影响

  -葡萄糖苷酶比例为50%,液料比20∶1 (mL/g),在pH 4.5、45 ℃前提下水解木樨2.5 h,木樨浸膏得率可由间接提取的2.04%提高到3.27%,提高了60.29%,远高于单一利用β-葡萄糖苷酶以及果胶酶。pH和温度是影响酶活的2个主要要素,通过单要素试验发觉复配酶在pH 4.5时所得木樨浸膏得率最高,该pH值与β-葡萄糖苷酶最适pH分歧,但略低于果胶酶的最适pH,可能是复配酶处置过程中β-葡萄糖苷酶起主导感化。同时研究还发觉复配酶在40~50 ℃时所得木樨浸膏得率均连结较高程度,可能与所利用的工业酶制剂工作温度较为宽泛相关。此外,因为果胶酶能够添加动物细胞壁的通透性,所以复配酶中果胶酶的比例较小时会影响复配酶粉碎木樨细胞壁的结果,从而降低浸膏物质的提取。图1 多种酶处置对木樨浸膏得率的影响

  图2 各要素对木樨浸膏得率的影响

  使用Design-Expert V 8.0软件对表2的试验数据进行方差阐发,成果别离见表3、4。由表3能够得出,模子P值0.000 1,失拟项P值为0.158 20.1,所选模子显著,失拟项不显著,因而所选模子靠得住。在试验调查的6个要素中,液料比、pH、处置时间、酶添加量以及复配酶中

  -葡萄糖苷酶比例5个要素的P值0.000 1,其对木樨浸膏得率影响均显著。而温度的P值为0.686 50.05,申明温度对木樨浸膏得率影响不显著,可能是与所利用的果胶酶以及

  -葡萄糖苷酶的感化温度较为宽泛相关。表1 响应面试验要素程度表

  表2 响应面试验设想成果

  表3 响应面模子方差阐发

  为0.986 7,R2校正为0.972 9,两个值较为接近,且信躁比为30.2464,可知回归方程拟合度和可托度均较高,试验误差较小,故可用此模子对复配酶处置制备木樨浸膏的工艺前提进行优化与预测。表2中的试验数据用Design-Expert V8.0软件进行多元回归拟合阐发,忽略影响不显著要素,得复配酶法处置木樨所得木樨浸膏得率(Y)的多元二次回归方程为:

  -葡萄糖苷酶比例、pH-时间以及pH-

  -葡萄糖苷酶比例对木樨浸膏得率的影响,见图3。从图3能够看出,当液料比力小时,因为酶液对样品的浸湿不足从而影响酶解的结果,所以在试验范畴内改变pH、时间或β-葡萄糖苷酶比例,木樨浸膏得率的变化并不显著。而因为利用的复配酶中

  -葡萄糖苷酶和果胶酶的最适pH具有必然的差别,所以pH-β-葡萄糖苷酶比例的交互影响就显得更为显著。跟着复配酶中β-葡萄糖苷酶比例的添加,pH值越趋于其最适pH。可是过高的β-葡萄糖苷酶比例也降低了复配酶中果胶酶的比例,晦气于浸膏物质的浸出。而较高的pH值虽然能够无效提高果胶酶的活性,可是会降低β-葡萄糖苷酶活性,从而削减了糖苷类前体物质的释放,降低浸膏得率。图3 pH-液料比、时间-液料比、

  -葡萄糖苷酶比例48.1%,木樨浸膏理论得率可达3.38%。尝试按此最佳前提进行验证,颠末3次平行尝试所得木樨浸膏得率为3.32%,相对误差为-1.78%,尝试值与模子预测值比力接近,可得出此模子靠得住。

  2.3 复配酶处置所得木樨浸膏香气物质含量变化通过GC-MS对复合酶处置所得木樨浸膏及未经酶处置间接提取所得木樨浸膏进行了检测。GC-MS检测成果表白,判定出的化合物次要为醇类、脂肪酸及其酯类、烷烃类、烯烃类以及醛酮类。复合酶处置所得木樨浸膏共判定出无效成分60种,略高于间接提取的58种。且采用复配酶处置木樨与间接提取比拟,浸膏中的组分发生较着的变化,此中脂肪酸及其酯类以及醇类化合物的数量均有所添加。陶清等

  -葡萄糖苷酶和果胶酶复配处置木樨,无效提高木樨浸膏得率的同时也提高了木樨浸膏中醇类和脂肪酸及其酯类物质的数量,总体提拔了浸膏的质量。复配酶处置对木樨浸膏中次要香气物质含量的影响见图4。木樨浸膏中二氢芳樟醇、β-紫罗兰酮、

  -癸内酯、二氢-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰醇等以游离态或无味的糖苷形式具有于动物组织中,具有浓重的香气,是木樨次要呈香物质[19]。由图4可知,复配酶处置对木樨浸膏中的次要香气物质含量影响较大。木樨浸膏中二氢芳樟醇的含量由未经酶处置的0.55%提高到0.70%,添加了27.27%。β-紫罗兰醇、橙花叔醇未在对照试验中检出,但复配酶处置所得木樨浸膏中β-紫罗兰醇含量为0.87%,而橙花叔醇含量为0.22%。复配酶处置后木樨浸膏中γ-癸内酯、二氢-β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮的含量显著提高,与未经酶处置间接提取比拟别离提高了116.36%,247.06%,100.00%。复配酶处置能显著提高浸膏中香叶醇的含量(P0.05),与对拍照比提高了72.84%,并将柠檬烯含量从0.28%提高到0.32%。由此能够得出,β-葡萄糖苷酶能够感化于连系态的糖苷前体物质,使之生成为游离的芬芳物质,从而添加浸膏中次要香气物质的含量。而形成动物细胞壁胞间层、次生壁以及初生壁的次要成分是果胶质。将β-葡萄糖苷酶和果胶酶进行复配利用,β-葡萄糖苷酶水注释放木樨香气物质前体,果胶酶水解果胶质,添加了细胞壁的通透性,二者配合感化能够无效地浸出更多的呈香物质。图4 复合酶处置对木樨浸膏次要香气物质含量的影响

  -葡萄糖苷酶和果胶酶复配处置木樨制备木樨浸膏得率远高于单一酶处置和不经酶处置。复合酶处置所得木樨浸膏得率比间接提取提高了62.75%,提拔幅度远高于汪海波等[7]利用单一酶处置制备木樨浸膏的。此外,目前较多的工艺研究次要集中在工艺前提优化,提拔产量方面,而对于所得木樨浸膏的质量较少涉及。本研究采用β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配处置木樨制备木樨浸膏,在无效提高产量的同时还无效提拔了木樨浸膏的质量。与间接提取比拟,复合酶处置所得浸膏中呈香物质的数量显著提拔,二氢-

  -紫罗兰酮、γ-癸内酯、二氢芳樟醇、β-紫罗兰酮、柠檬烯以及香叶醇等次要香气物质的含量提拔显著,别离提高了247.06%,116.36%,27.27%,100.00%,14.29%,72.84%。 本研究充实显示了β-葡萄糖苷酶和果胶酶复配在木樨浸膏制备中的使用潜力,值得进行进一步的中试放大研究,摸索木樨浸膏制备新工艺。参考文献

  作者简介:张雪松,男,江苏农林职业手艺学院副传授,博士。

  通信作者:赵林果(1965—),男,南京林业大学传授,博士。/p>